Skupina Long Lija na School of Life Sciences Univerze v Pekingu je objavila članek z naslovom "Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the Molecular pathway of mitochondrial preprotein import through the TOM-TIM23 supercomplex", objavljen v Nature Structural & Molecular Biology. Študija poroča o strukturnih in biokemičnih rezultatih superkompleksa TOM-TIM23, ki posreduje pri transportu beljakovin v mitohondrijih, razkriva novo pot uvoza beljakovin skozi kompleks TOM preko zunanje membrane mitohondrijev in na novo definira sestavo jedra transporterskega kompleksa TIM23 v notranji mitohondrijska membrana.
Kot eden najpomembnejših organelov v evkariontskih celicah igrajo mitohondriji pomembno vlogo pri oskrbi z energijo, znotrajceličnem metabolizmu, homeostazi in apoptozi. Mitohondriji imajo edinstveno notranjo in zunanjo dvoslojno lipidno membransko strukturo, v kateri je porazdeljenih več kot 1000 proteinov. 99 % mitohondrijskih proteinov kodirajo citosolni geni, sintetizirani v ribosomih v citoplazmi in prepeljani preko membrane v mitohondrije, da opravljajo svoje funkcije. Zato je transport mitohondrijskih proteinov ključnega pomena za vzdrževanje in uravnavanje mitohondrijske aktivnosti, mutacije v sorodnih genih pa so tesno povezane z razvojem številnih presnovnih bolezni in rakov pri ljudeh. Skupina Li Longa si prizadeva raziskati molekularne mehanizme, s katerimi mitohondrijske beljakovine vstopajo v mitohondrije, objavljeno delo pa vključuje razrešitev poti, po kateri beljakovine mitohondrijske membrane vstopajo v notranjo membrano prek transportnega kompleksa TIM22 (Zhang Y. et al Cell Research 2021). Vloga superkompleksa TOM-TIM23 pri transportu mitohondrijskih beljakovin je v tej študiji še pomembnejša. Ta superkompleks, sestavljen iz več deset proteinskih podenot, se razteza čez notranjo in zunanjo mitohondrijsko dvoslojno membrano in nadzoruje transport več kot 500 mitohondrijskih topnih in membranskih proteinov. V zadnjih 40 letih so raziskovalci obsežno in intenzivno preučevali posamezne podenote transportnih kompleksov TOM in TIM23. Vendar pa je zaradi zelo dinamične narave tega superkompleksa razumevanje osrednjega vprašanja, kako se te podenote sestavijo, da tvorijo transportno pot beljakovin, še vedno zelo omejeno, zlasti za kompleks TIM23 v endosomski membrani, kjer je sestava jedra transportna enota je zelo nejasna.
V tej študiji so avtorji najprej začeli s sestavljanjem stabilnega superkompleksa TOM-TIM23, raziskali različne sheme sestavljanja in se končno odločili za spajanje zelenega fluorescentnega proteina z mitohondrijskim proteinom kot transportnim substratom ter zajeli vmesno stanje TOM-TIM23 superkompleks za transport proteinskih substratov v celicah kvasovk. Po čiščenju in vitro bi lahko to vmesno stanje še vedno stabilizirali za nadaljnje študije strukturne biologije in biokemije. Z analizo enega delca tega vmesnega stanja s krioelektronsko mikroskopijo so avtorji ugotovili, da obstaja neposredna interakcija med kompleksom TOM, ki se nahaja v zunanji membrani, in kompleksom TIM23, ki se nahaja v notranji membrani, kar povezuje notranjo in zunanjo mitohondrijsko membrano , ki učinkovito prenaša proteinski substrat iz zunanje mitohondrijske membrane v notranjo membrano (slika 1a). Zlasti kompleks TOM je bil razrešen na ločljivost 4, 1 Å. Struktura je razkrila "polarno aminokislinsko pot" znotraj notranje stene podenote kanala Tom40, ki je ohranjena med vrstami in posreduje pri prehodu proteinskega substrata skozi vmesne pore Tom40 v nezloženi obliki (slika 1b). Ta pot se razlikuje od dveh transmembranskih poti v Tom40, ki sta bili predhodno predlagani na podlagi biokemičnih poskusov, kar dokazuje vsestranskost kompleksa TOM pri učinkovitem prepoznavanju in transportu različnih mitohondrijskih proteinov.
Slika 1. Struktura superkompleksa TOM-TIM23. (a) Shematski sestav in struktura krioelektronske mikroskopije superkompleksa TOM-TIM23. (b) Strukturni model krioelektronske mikroskopije kompleksa TOM, ki vsebuje proteinski substrat. (c) AlphaFold2 strukturni model heterotrimerja Tim17-Tim23-Mgr2
Poleg tega so avtorji sistematično uvedli nenaravne aminokisline na različnih mestih proteinskega substrata in preiskali okolico proteinskega substrata v transportni poti TOM-TIM23 z uporabo fotomreženja, s čimer so identificirali jedrno podenoto, ki neposredno pomaga substratu prečkati dve lipidni membrani. Eksperimentalni rezultati so pokazali, da se lahko C-terminalni fragment proteinskega substrata navzkrižno poveže s podenoto Tom40 zunanje membrane, kar je rezultat v skladu s strukturnimi opazovanji. Presenetljivo pa je, da se N-terminalni fragment proteinskega substrata navzkrižno poveže s podenotama Tim17 in Mgr2 v notranji membrani, ne pa tudi s podenoto Tim23, za katero se običajno identificira, da predstavlja transportni kanal notranje membrane. Ta rezultat nakazuje, da lahko pride do znatne pristranskosti v zaznavanju osrednje transportne poti kompleksa TIM23 v preteklih študijah. Za nadaljnjo identifikacijo osnovnih transportnih podenot in poti v TIM23 so avtorji uporabili kombinacijo modeliranja AlphaFold2, biokemičnega navzkrižnega povezovanja, genetike kvasovk in in vitro transporta mitohondrijskih proteinov ter ugotovili, da je glavna komponenta kompleksa TIM23 heterotrimer sestavljen iz podenot Tim23, Tim17 in Mgr2, pri čemer Tim17 in Mgr2 iz oči v oči tvorita strukturo, podobno kanalu, medtem ko se Tim23 veže na Tim17 v obliki hrbta za hrbtom in ni vključen v tvorbo kanala (slika 1c). ). Med translokacijo proteina prehaja proteinski substrat skozi kanalsko strukturo, ki jo tvorita Tim17 in Mgr2, in ne pride neposredno v stik s podenoto Tim23. Poskusi z mutagenezo so pokazali, da knockdown Mgr2 v kvasovkah ni vplival na translokacijo beljakovin, kar nakazuje, da je samo Tim17 potreben v kanalski strukturi, ki jo tvorita Tim17 in Mgr2. Razlog, zakaj lahko Tim17 pomaga beljakovinam pri prehodu skozi endosomsko membrano, je njegova edinstvena površinska porazdelitev aminokislin: na eni strani ima Tim17 visoko ohranjeno negativno nabito območje na vhodu v endosomsko membrano, ki lahko moti lokalizirano Po eni strani ima Tim17 visoko ohranjeno negativno nabito območje na vhodu notranje membrane. , ki lahko moti lokalno fosfolipidno dvoslojno strukturo in zniža energijsko oviro za beljakovine, da prečkajo lipidno membrano; po drugi strani pa ima Tim17 ohranjeno hidrofobno regijo v središču poti, ki pomaga ohranjati notranjo membrano mitohondrija v nepredušnem stanju in vzdrževati membranski potencial, potreben za fiziološke aktivnosti mitohondrijev. Če vzamemo skupaj rezultate različnih strukturnih in biokemičnih eksperimentov, lahko sklepamo, da kompleks TIM23 s podenoto Tim17 v svojem jedru sprejme mešani način za pomoč pri translokaciji beljakovin, tj. Tim17 se lahko bodisi dinamično veže z drugimi podenotami, da tvori kanal, da pomaga beljakovinam skozi membrano, ali pa Tim17 deluje v načinu dela insercijskega encima, da doseže samo translokacijo beljakovin brez potrebe po oblikovanju kanala. Ta rezultat popravlja napačno dojemanje na terenu v zadnjih 40 letih, da podenota Tim23 predstavlja osrednji kanal.
Če povzamemo, ta študija je razvila novo strategijo za študije transporta beljakovin, razkrila kritično pot mitohondrijskih proteinov, da prečkajo dvoslojno lipidno membrano prek superkompleksa TOM-TIM23 (slika 2), ovrgla dolgoletno terensko znanje o ključnih komponentah transportni kompleks notranje membrane TIM23 in odkril popolnoma nov način delovanja proteinskega transportnega encima, ki postavlja trdne temelje za celovito in poglobljeno razumevanje mitohondrijske biosinteze. sintezo, ki postavlja trdne temelje za celovito in poglobljeno razumevanje mitohondrijske biosinteze.
Slika 2. Mitohondrijska transportna pot TOM-TIM23
Long Li je ustrezni avtor prispevka in Xueyin Zhou, doktorski študent iz razreda Peking University-Tsinghua Joint Center for Life Sciences iz leta 2018, Yuqi Yang, doktorski študent iz razreda School of Life Sciences iz leta 2019, dr. Peng Wang s platforme za krio-elektronsko mikroskopijo Pekinške univerze in Shanshan Wang, doktorski študent iz razreda Šole za vede o življenju leta 2020, sta so-avtorja. Dongjie Sun, nekdanji tehnik v Li Longovem laboratoriju, Xiaomin Ou, doktorski študent na Visoki šoli za znanosti o življenju, letnik 2022, in Yuke Lian, doktorski študent na Visoki šoli za znanosti o življenju, letnik 2021, so pomembno prispevali k to raziskavo. Prof. Ning Gao in pridruženi raziskovalec Ningning Li s Šole za vede o življenju Pekinške univerze in raziskovalec Xinzheng Zhang z Inštituta za biofiziko Kitajske akademije znanosti sta zagotovila veliko pomoč pri izračunu podatkov krioelektronske mikroskopije, prof. Qing Li in prof. Gain Chang s Fakultete za vede o življenju Pekinške univerze je zagotovil pomembne smernice o genetiki kvasovk oziroma poskusih fotomreženja. Raziskovalno delo so podprli platforma za krioelektronsko mikroskopijo Pekinške univerze, Center za visokozmogljivo računalništvo, Instrumentacijski center šole znanosti o življenju in Nacionalna platforma za beljakovine Phoenix, financiral pa ga je Državni ključni laboratorij za membransko biologijo, Skupni center Pekinške univerze-Tsinghua za vede o življenju in Nacionalna naravoslovna fundacija Kitajske.
